Cultivo y Aislamiento de microorganismos

 

Cultivo y Aislamiento de microorganismos

Materiales

 

·         Gelatina

·         Caldo nutriente

·         Recipientes

·         Placas de Petri

·         Olla

·         Cocinilla

·         Cotonetes

·         Ansa bacteriológica (figura 2)

Fundamento teórico

Los microorganismos, como las bacterias, son seres ubicuos que requieren de condiciones ambientales y nutricionales específicas para su crecimiento y multiplicación. Un medio de cultivo es una preparación que contiene los nutrientes esenciales en proporciones adecuadas y un pH que permita el desarrollo de estos microorganismos en el laboratorio. Para que una bacteria pueda crecer, necesita:

·         Una fuente de carbono y energía: Para la síntesis de biomoléculas y procesos metabólicos.

·         Una fuente de nitrógeno: Para sintetizar proteínas y ácidos nucleicos.

·         Sales minerales y vitaminas: Que actúan como cofactores enzimáticos.

·         Agua: Como solvente universal para todas las reacciones bioquímicas.

El caldo casero de verduras, carne, fideos y arroz constituye una excelente base nutritiva, ya que combina estos elementos de forma compleja.

2. Los Componentes del Medio de Cultivo Casero

A. El Caldo Nutritivo:

·         Verduras: Aportan vitaminas (del complejo B, C), minerales (hierro, magnesio, potasio) y carbohidratos simples y complejos que sirven como fuentes de carbono y energía.

·         Carne: Proporciona una fuente rica en nitrógeno orgánico a través de proteínas (como el colágeno y la miosina) y péptidos, que son degradados y utilizados por las bacterias para construir sus propias proteínas. También aporta lípidos y minerales.

·         Fideos y Arroz: Son fuentes concentradas de almidón y otros polisacáridos. El almidón, compuesto por amilosa y amilopectina, es una macromolécula que muchas bacterias pueden hidrolizar con enzimas específicas (amilasas) para obtener glucosa, su principal moneda energética.

B. Los Agentes Solidificantes: Agar-Agar vs. Gelatina

La elección del agente solidificante es crítica y determina las propiedades físicas del medio.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

	Agar-Agar	Gelatina
Origen	Polisacárido extraído de algas rojas.	Proteína derivada del colágeno animal (huesos, piel).
Composición	Cadenas de galactanos. No es nutritiva para la mayoría de bacterias.	Cadenas de aminoácidos (especialmente glicina, prolina, hidroxiprolina).
Punto de Fusión	Alto (~85°C). Se debe fundir con calor.	Bajo (~35-40°C). Se funde a temperatura corporal.
Punto de Gelificación	~32-40°C. Forma un gel firme a temperatura de incubación (37°C).	~<25-30°C. Permanece sólida solo en refrigeración.
Estabilidad Enzimática	Muy estable. Pocas bacterias producen "agarasas" para degradarlo.	Inestable. Muchas bacterias producen gelatinasas, enzimas proteolíticas que licúan el medio.
Aplicación en la Práctica	Ideal para observar colonias aisladas. Permite incubación a 37°C.	Útil para demostrar la producción de gelatinasa como prueba bioquímica. Se licúa si la bacteria posee esta enzima.

3. La Esterilización: Fundamentos del Autoclavado en Olla a Presión

La preparación de un medio de cultivo requiere esterilidad para asegurar que solo crezcan los microorganismos que nosotros inoculemos, y no contaminantes ambientales.

·         El Principio del Autoclavado: La esterilización por calor húmedo bajo presión es el método más eficaz. El agua, al hervir en un recipiente cerrado como una olla a presión, aumenta la presión interna y, en consecuencia, eleva el punto de ebullición del agua por encima de los 100°C.

·         Condiciones Letales: En una olla a presión casera, es posible alcanzar temperaturas entre 115°C y 121°C. A esta temperatura, el vapor de agua a presión coagula irreversiblemente las proteínas estructurales y enzimáticas de todo microorganismo, incluyendo sus formas de resistencia como las esporas bacterianas.

·         Protocolo: Se recomienda una esterilización de 15 a 20 minutos a 121°C (lo que generalmente equivale a mantener la válvula de la olla silbando durante ese tiempo). Es crucial que el medio se enfríe lo suficiente antes de verterlo (agar: ~45-50°C; gelatina: baño de agua tibia para no sobrecalentar) para evitar la condensación excesiva y la degradación de los nutrientes.

 

Procedimiento:

Se prepara una gelatina con un caldo de nutrientes (caldo de vegetales, carne, poca azúcar y sal), se vierte en un recipiente y se deja enfriar.

·         Composición del caldo:

o   1/2 cucharada chica de sal

o   1 cucharada chica de azúcar

o   Trozos de vegetales y frutas variados

o   Trozo pequeño de carne

o   1 cucharada sopera de arroz

o   1 cucharada sopera de avena

o   1 puñado pequeño de fideos

o   1 litro de agua

·         Procedimiento:

o   Colocar todos los ingredientes en la olla y hervir durante 15 minutos

La concentración de la gelatina debe ser el doble de la normal para que no se licue a temperatura ambiente.

·         Procedimiento:

o   Medir 125 ml del caldo nutritivo y hacerlo hervir

o   Agregar el caldo caliente al polvo de un paquete de gelatina y disolver completamente

o   Agregar 125 ml de caldo nutritivo frío

o   Verter en los recipientes, esperar que enfríe y poner en la heladera.

En el caso de que se use un medio agar-agar

·         Calcular la cantidad de agar-agar necesaria para el volumen de medio a realizar

·         Pesar y diluir al agar-agar calculado en una parte del líquido (caldo nutritivo) sin dejar grumos y poner a hervir el resto del caldo.

·         Mezclar ambos y llevar a hervor.

·         Verter en las placas de Petri o recipientes

·         Autoclavar

 

Siembra

Con un cotonete se toma una muestra del interior de la mejilla o de donde se desee muestrear, y se toca con este toda la superficie de la gelatina o el sitio puntual de la placa donde se desea inocular. Se coloca el recipiente en un sitio oscuro y a temperatura ambiente, o si es posible en una incubadora. Dejar por 5 días, luego de los cuales seguramente haya crecimiento de bacterias y hongos (figura 1). Se puede usar este resultado para observar las diferencias entre las colonias bacterianas y los micelios y fructificaciones de los hongos.

Figura 1. Medio con crecimiento de hongos y bacterias

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               

 

Una vez pronto el crecimiento, con un ansa tocar una colonia de bacterias, con mucho cuidado de no tocar hongos en el proceso. Destapar una placa de Petri con medio autoclavado, bajo un mechero, y rápidamente, para evitar la entrada de esporas, distribuir la muestra por todo el medio (Figura 2)

 

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                             Colocar las placas de Petri en un sitio oscuro y a temperatura ambiente (5 días), o en una incubadora (2 días).  Observar el crecimiento bacteriano en el trillo que realizamos con el ansa, cuidar de abrir lo menos posible la placa de Petri. Realizar observaciones cada 2 o 3 días.

 

Figura2. A  y B, placas a los 5 días de sembradas. C, Placas a los 19 días de sembradas. 

		Mira este video para recordar el procedimieto

 

Lista de elementos:

·         Gelatina

·         Agar-agar

·         Caldo nutritivo

·         Olla

·         Recipientes, placas de Petri

·         Fuente de bacterias (jamón o vegetales en descomposición)

·         Cotonetes

·         Ansa

·         Mechero